影響電泳的主要因素有哪些,?
影響電泳的主要因素為:
1.電泳介質(zhì)的pH值
溶液的pH值決定帶電物質(zhì)的解離程度,,也決定物質(zhì)所帶凈電荷的多少.對蛋白質(zhì),,氨基酸等類似兩性電解質(zhì),,pH值離等電點(diǎn)越遠(yuǎn),粒子所帶電荷越多,,泳動(dòng)速度越快,反之越慢,。因此,,當(dāng)分離某一種混合物時(shí),應(yīng)選擇一種能擴(kuò)大各種蛋白質(zhì)所帶電荷量差別的pH值,,以利于各種蛋白質(zhì)的有效分離.為了保證電泳過程中溶液的pH值恒定,,必須采用緩沖溶液。
緩沖液的離子強(qiáng)度
溶液的離子強(qiáng)度(Ion intensity)是指溶液中各離子的摩爾濃度與離子價(jià)數(shù)平方的積的總和的1/2.帶電顆粒的遷移率與離子強(qiáng)度的平方根成反比,。低離子強(qiáng)度時(shí),,遷移率快,但離子強(qiáng)度過低,,緩沖液的緩沖容量小,,不易維持pH恒定.高離子強(qiáng)度時(shí),遷移率慢,但電泳譜帶要比低離子強(qiáng)度時(shí)細(xì)窄,。通常溶液的離子強(qiáng)度在0.02~0.2之間,。
I=1/2∑CiZi2 (I:離子強(qiáng)度;Ci:離子的摩爾濃度,;Zi:離子價(jià)數(shù). )
0.154M NaCl溶液的離子強(qiáng)度為:
I= 1/2(0.154×12+0.154×12)=0.154
0.015M Na2SO4溶液的離子強(qiáng)度為:
I= 1/2(0.015×2×12+0.015×22)=0.045
3.電場強(qiáng)度
電場強(qiáng)度(電勢梯度Electric field intensity)是指每厘米的電位降(電位差或電位梯度).電場強(qiáng)度對電泳速度起著正比作用,,電場強(qiáng)度越高,帶電顆粒移動(dòng)速度越快,。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要,,電泳可分為兩種:一種是高壓電泳,所用電壓在500~1000V或更高.由于電壓高,,電泳時(shí)間短(有的樣品需數(shù)分鐘),,適用于低分子化合物的分離,如氨基酸,,無機(jī)離子,,包括部分聚焦電泳分離及序列電泳的分離等。因電壓高,,產(chǎn)熱量大,,必須裝有冷卻裝置,否則熱量可引起蛋白質(zhì)等物質(zhì)的變性而不能分離,,還因發(fā)熱引起緩沖液中水分蒸發(fā)過多,,使支持物(濾紙,薄膜或凝膠等)上離子強(qiáng)度增加,,以及引起虹吸現(xiàn)象(電泳槽內(nèi)液被吸到支持物上)等,,都會影響物質(zhì)的分離.另一種為常壓電泳,產(chǎn)熱量小,,室溫在10~25℃分離蛋白質(zhì)標(biāo)本是不被破壞的,,無需冷卻裝置,一般分離時(shí)間長,。
4.電滲現(xiàn)象
在電場中液體對于一個(gè)固體的固定相相對移動(dòng)稱為電滲.在有載體的電泳中,,影響電泳移動(dòng)的一個(gè)重要因素是電滲。最常遇到的情況是γ-球蛋白,,由原點(diǎn)向負(fù)極移動(dòng),,這就是電滲作用所引起的倒移現(xiàn)象.產(chǎn)生電滲現(xiàn)象的原因是載體中常含有可電離的基團(tuán),如濾紙中含有羥基而帶負(fù)電荷,,與濾紙相接觸的水溶液帶正電荷,,液體便向負(fù)極移動(dòng)。由于電滲現(xiàn)象往往與電泳同時(shí)存在,,所以帶電粒子的移動(dòng)距離也受電滲影響,;如電泳方向與電滲相反,,則實(shí)際電泳的距離等于電泳距離加上電滲的距離.瓊脂中含有瓊脂果膠,,,其中含有較多的硫酸根,,所以在瓊脂電泳時(shí)電滲現(xiàn)象很明顯,許多球蛋白均向負(fù)極移動(dòng),。除去了瓊脂果膠后的瓊脂糖用作凝膠電泳時(shí),,電滲大為減弱.電滲所造成的移動(dòng)距離可用不帶電的有色染料或有色葡聚糖點(diǎn)在支持物的中心,以觀察電滲的方向和距離,。
電泳技術(shù)
帶電顆粒在電場作用下,,向著與其電性相反的電極移動(dòng),稱為電泳(electrophoresis, EP),。利用帶電粒子在電場中移動(dòng)速度不同而達(dá)到分離的技術(shù)稱為電泳技術(shù),。
1807年,由俄國莫斯科大學(xué)的斐迪南·弗雷德里克·羅伊斯(Ferdinand Frederic Reuss)最早發(fā)現(xiàn),。
1936年瑞典學(xué)者A.W.K.蒂塞利烏斯設(shè)計(jì)制造了移動(dòng)界面電泳儀 ,,分離了馬血清白蛋白的3種球蛋白,創(chuàng)建了電泳技術(shù),。
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